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如何获得精准的Western Blot实验结果
点击次数:4777 发布日期:2019-10-25  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
如何做出一手漂亮的Western Blot实验结果
 
蛋白质免疫印迹杂交实验(Western Blotting)是成熟 mRNA 翻译指导蛋白质合成量分析检测手段中最经典和最广泛为业界认可的一种,也是论文中最常见的数据呈现形式之一。虽然Western Blot实验原理比较简单,但是实验耗时长、步骤繁琐和实验结果重复性差,导致刚进实验室的小伙伴们,实验做的焦头烂额。
那么如何做出一手漂亮的Western Blot实验结果呢,请小伙伴们跟随星博士的脚步,了解Western Blot实验的相关知识,let's go!
 

 
Western Blotting实验原理:
 
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即,简称WB。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织进行着色,将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物(NC膜或PVDF膜)上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。
 

 
Western Blotting实验步骤:
 

 
样品制备
 
样本制备是决定蛋白质免疫印迹是否成功的关键步骤之一。样本必须进行研磨、匀浆、超声处理。膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还需要注意的一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要加入PMSF抑制酶的活性。思科捷为大家提供强、中、弱三种RIPA裂解液,以及适用于各种类型的蛋白酶抑制剂。
 

 
电泳分离
 
准备好样品后,第二步就是上样和电泳分离了,上样之前小伙伴们要做的必要步骤是确定蛋白质浓度,根据蛋白质浓度确定上样量。星博士给大家推荐BCA和Bradford两款蛋白浓度测定试剂盒,小伙伴们可以根据自己的实验需求自行选择。
 
测完了蛋白质浓度,接下来就是上样了。首先要制备凝胶,选用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(EC0003),简单省时。然后安装电泳槽,将胶片安置在电泳槽中,在电泳装置中加入SDS-PAGE电泳液。思科捷提供10×的电泳液,稀释后直接使用,方便快捷。
 

 
上样结束后,设置电泳程序一般浓缩胶80V,分离胶120V,电泳时间一般为1-2小时,根据溴酚蓝指示位置选择停止电泳时间即可。
 
转膜
 
针对特定分子量大小靶蛋白而选择适当转膜条件(转膜时间,转膜缓冲液和必要低温环境)能够将 SDS-PAGE 胶上蛋白样品尽可能完全转移到印迹膜上,同时减少蛋白不必要的降解,这对于最终获得清晰、可信结果也是需要考虑因素。转膜方式主要包括湿式电印迹法(最佳转膜方法)、半干式电印迹(可选的替代转膜方法)以及干式电印迹(有限灵敏度的转膜方法)。根据实验室习惯和需求,小伙伴们可以自行选择转膜方式。
 
膜的选择
 
膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑,例如做分子量小于20kDa的小蛋白,0.45um的膜是不可取的,因为可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白含量不确定,从而影响最终结果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白选择0.2um的膜,而大于20KDa的蛋白选择0.45um的膜。常见的膜有NC膜和PVDF膜,区别如下:
 
 
NC
PVDF
灵敏度和分辨率
背景
较高
结合能力
80-110ug/cm2
125-200ug/cm2
材料质地
干的NC膜易脆
机械强度高
溶剂耐受性
操作程序
缓冲液润湿,避免气泡
使用前100%甲醇润湿
检测方式
ECL检测
ECL检测
价格
较便宜
较贵
 
 
膜方式的选择
 
湿转:
 
通常我们在做湿转的时候,选择100V恒压(高强度,因为低强度时间较长,且效率较低),电流控制在120-350mA之间,分子量在60KD以下的60分钟即可,分子量在60KD以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所研究的两个蛋白分子量差异比较大(如GAPDH 37KD,Ki67 358KD),你可以考虑将胶从中间分开,两部分分别采用不同时间转印,能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次,之后电流会过大,不适合再使用。
 
湿转
优点
缺点
转膜条件灵活容易进行调整
Buffer加热可能干扰转印
多种Buffer可用于优化转印
在转印的时候需要制冷装置
可以延长转印时间
需要大量的转膜缓冲液
可用于定量Western Blot
 
 

 
半干转:
 
对于半干转来说,也需要进行堆叠组装(滤纸,胶,膜需要放在转印buffer中进行预平衡)放在装置电极板的底部,盖上上极板,高强的电流通过三明治结构,转印速度较快,一般小于1h。
 

 
半干转
优点
缺点
转膜速度快
低分子量蛋白容易转过
用不连续的Buffer系统优化转印的蛋白
对于分子量>120KDa的蛋白,转印较困难
转膜缓冲液用量少
转膜过程容易干胶
容易安装
对于定量的Western实验不推荐使用
对于同一蛋白的多张膜的分析比较有益
 
 
需要注意的是:低温对于膜的转印是至关重要的,尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。针对刚建的实验室平台或者一些新蛋白的研究,经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率(胶用考马斯亮蓝加热染色,膜用丽春红染色,均只需几分钟,并不耽误太多时间),不然后面的实验既费时也费抗体。
 
封闭
 
在做Western blot实验中,因固相载体(如NC膜,PVDF膜)表面有很多孔,通过电转,胶上的蛋白被转移到膜上,蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面孔里面,但是蛋白并不是连续的,而有很多空隙,抗体也是蛋白,也会被吸附在空的洞里,这样就会有很多非特异性的信号。
 
因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合,所以有“封闭”的说法。星博士在此介绍常见封闭液的一些特点,有助于大家选择:
 
常见的封闭液——BSA
 
BSA是最常用的封闭液,成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的,BSA有很强的免疫原性,会导致产生很多针对BSA的抗体,为避免交叉反应,不能用BSA,脱脂奶粉封闭,可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭液。
 
常见的封闭液——脱脂奶粉
 
脱脂奶粉最大的优点是价格便宜,但由于成分相对复杂,所以适用范围要狭窄一些。针对磷酸化蛋白的检测不能用脱脂奶粉,脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白,使用会造成高背景磷酸化抗体也许会导致背景增加,此外,因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。
 
封闭体系并不是一成不变的,不同的封闭体系往往会得到不一样的实验结果,由此可见,做Western Blot实验中,封闭液的选择也是需要谨慎的。
 

不同封闭体系结果的差异
 
抗体孵育
 
一抗一般按照说明书进行稀释后,室温孵育1-2h,或者4℃过夜。为了让抗体充分与蛋白结合,大多数实验室一般会选择4℃过夜。一抗孵育结束后TBST洗涤三次,用稀释后的二抗,室温孵育1-3小时,TBST洗涤三次。
 
抗体是决定Western Blot实验成败的最关键因素,选择具有一定文献引用数的品牌不仅更容易得到清晰可信的结果同时更能够得到同行认可,针对一些表达峰度高且稳定的蛋白可以选择国产化抗体,既能保证实验结果准确性又可降低实验成本,抗体的保存往往也是大家最容易忽略的一个环节,而因抗体保存不当造成实验失败的例子比比皆是。
 
保存温度和条件(仅供参考)
 
对于很多抗体而言,分装成小等份并冻存于-20℃或-80℃是最佳保存条件。分装成小等份可最大程度减少由冻融造成的抗体效价降低,以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次,如有剩余,可将剩余物保存于4℃,建议一周内用完。在收到抗体时,在10000×g下离心20秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液,并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10μl;等份越小,储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。
 
在大多数情况下,收到抗体时在4℃下保存一至两周,然后再冷冻进行长期保存是可以接受的,但也许腹水液是例外,它可能包含蛋白酶,因而应该尽快冻存。不同品牌的抗体保存方式往往不同,具体保存方式需参考产品说明书。
 
检测
 
抗体孵育完,就到了Western Blot实验的最后一步——检测了。
 
目前最常用的检测方法是ECL化学发光法,主要针对HRP标记的二抗。思科捷为大家提供极超敏和超敏两种ECL发光液供大家选择。一款合适的发光液能使你的Western Blot图片更加美观。
 

 
Western Blot的基础部分就先讲到这里,欢迎小伙伴们在评论区留言,针对Western Blot实验的问题,星博士将一一为大家解答。
来源:青岛浩赛科技股份有限公司
联系电话:0532-55679910
E-mail:xiaoyiyun@haosail.com

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